Николай Федорович Гамалея родился 5 (17) февраля 1859 года в Одессе, в семье старинных казаков. Один из его предков, полковник Григорий Высоцкий, служил у Богдана Хмельницкого. Дед Михаил Леонтьевич был врачом и первым в России опубликовал исследование о сибирской язве. Отец, гвардейский офицер, участвовал в Отечественной войне 1812 года.
С детства Николай был увлечен чтением и научился самостоятельно изучать естественные науки. Его выбор в пользу медицины и науки был предопределен прочтением книги Майкла Фарадея «История свечи». Это произведение глубоко повлияло на его жизненный путь, привив любовь к естествознанию.
Гамалея получил отличное образование в Новороссийском и Страсбургском университетах, а также в Военно-медицинской академии в Петербурге. В Новороссийском университете он изучал микробиологию и бактериологию под руководством выдающегося физиолога Ильи Мечникова, став одним из первых российских ученых в этих областях.
В Париже Гамалея работал в лаборатории Луи Пастера, где изучал бешенство и методы прививки от него. Вернувшись в Россию, он организовал первую станцию для прививок против бешенства в Одессе.
Защитив докторскую диссертацию о холере, Гамалея стал одним из первопроходцев в микробиологии и бактериологии в России. Он разработал теории об инфекциях, воспалении, вирусной этиологии опухолей и внес важный вклад в развитие патологии, иммунологии и биохимии микроорганизмов.
В Петербурге он стал руководителем оспопрививательного института и активно боролся с эпидемиями. Гамалея был инициатором всеобщей вакцинации от оспы в стране.
Оставаясь в России после Октябрьской революции, Гамалея продолжил свою научную деятельность. Он умер 29 марта 1949 года, оставив важное научное наследие и воспитав целое поколение советских микробиологов.