Семён Алексеевич Тимошенко родился 6 января (по новому стилю 18 января) 1899 года в Петербурге. В 1918—1920 годах он учился на общем отделении Института гражданских инженеров (ИГИ) и посещал мастерскую Всеволода Мейерхольда. В 1920 году успешно завершил режиссёрские курсы при театральном отделе Наркомпроса в Петрограде.
С 1919 по 1924 год Тимошенко работал актёром в театре БДТ, а затем стал актёром и режиссёром театра «Вольной комедии». Он принимал участие в 166 спектаклях за сезон и также приобрёл известность как конферансье в ночном кабаре «Балаганчик», где также писал множество пьес и миниатюр. В то время он участвовал в постановке массовых народных зрелищ и вёл драматические кружки.
С начала 1925 года Тимошенко работал режиссёром в киностудии «Севзапкино» (ныне «Ленфильм»). Первые десять лет своей кинокарьеры он снимал социальные драмы, посвящённые Октябрьской революции и Гражданской войне. С 1935 года он стал известен как режиссёр популярных кинокомедий, зачастую также являясь автором сценариев. В 1937 году он написал сценарий к фильму «Небо Испании», состоящему из киноновелл, который стал прообразом «Боевых киносборников» времён Великой Отечественной войны.
В 1942 году, во время блокады Ленинграда, Тимошенко был эвакуирован в Алма-Ату. Заметив его там, Сергей Эйзенштейн предложил сняться в фильме «Иван Грозный». Роль ливонского посла стала единственной известной ролью Тимошенко в кино.
Самым популярным фильмом Семёна Алексеевича стала кинокомедия «Небесный тихоход», выпущенная в 1946 году во время Великой Отечественной войны. В 2012 году фильм был восстановлен и колоризирован по заказу «Первого канала». За год выхода его посмотрели 21 миллион зрителей.
Много лет Тимошенко мечтал снять фильм о великом русском авиаторе Сергее Уточкине, и его замысел был осуществлён после его смерти в 1962 году в фильме «В мёртвой петле», где он также написал сценарий. Главную роль исполнил актёр Олег Стриженов.
Семён Алексеевич Тимошенко ушёл из жизни 13 ноября 1958 года и похоронен на Серафимовском кладбище в Санкт-Петербурге.
