Императорский Виленский университет преобразован из Главной виленской школы в Вильно. Он учреждён актом, подписанным императором Александром I 4 (16) апреля 1803 года, и стал главным учебным заведением и учреждением, управляющим просвещением в восьми губерниях Российской империи (Виленская, Гродненская, Минская, Могилевская, Витебская, Волынская, Подольская, Киевская). В 1803 году попечителем Виленского учебного округа был назначен князь Адам Чарторыйский (1770—1861), способствовавший расцвету университета.
Количество студентов росло от 290 в 1804 до 1 321 в 1830. К 1823 году стал крупнейшим университетом России и Европы, числом студентов превосходя Оксфордский университет. В университете действовали тайные студенческие патриотические организации (филоматы, филареты, «лучезарные»). В 1823 году по делу о принадлежности к ним были арестованы десятки воспитанников университета, включая Адама Мицкевича и после длительного пребывания в заключении высланы в различные города России. Адам Чарторыйский был смещён. Его место занял Н. Н. Новосильцев (1768—1838).
Из-за прямого участия или косвенной причастности студентов и преподавателей к восстанию 1831 года 1 мая 1832 года рескриптом Николая I университет упраздняется. Медицинский факультет преобразован в Медико-хирургическую академию (в 1842 году влита в Киевский университет Св. Владимира), теологический — в католическую Духовную академию (в 1844 году переведена в Санкт-Петербург).
С 1855 в зданиях университета располагался Музей древностей, позднее Публичная библиотека, архив, а также две мужские гимназии. В разное время в них учились литератор и коллекционер А. В. Жиркевич (1857—1927), польский государственный деятель Ю. Пилсудский (1867—1935), советский государственный деятель Ф. Э. Дзержинский (1877—1926), актёр В. И. Качалов (1875—1948), художник М. В. Добужинский (1875—1957), литовский композитор К. Галкаускас (1875—1963), теоретик литературы М. М. Бахтин (1895—1975).
