Лилия Толмачёва родилась в семье учителей, по разным данным, либо в Саратове, либо в селе Руднево Волгоградской области. Окончив школу, она поступила в Школу-студию МХАТ на курс Виктора Яковлевича Станицына, которую завершила в 1950 году. С 1952 года она работала в Саратовском ТЮЗе, а в 1955-1956 годах — в Театре имени Моссовета.
С 1956 года Толмачёва была актрисой театра «Современник», где исполнила одну из главных ролей — Ирину Бороздину в спектакле «Вечно живые» по пьесе В. С. Розова. Она быстро стала одной из ведущих актрис театра, сыграв Леночку в «В поисках радости» и Агнию Шабину в «Традиционном сборе» Розова, Тамару в «Пяти вечерах» и Надю в «Старшей сестре» А. Володина, а также Женщину, которую Он любил в «Четвёртом» К. Симонова. Среди её лучших ролей были Елизавета Александровна в «Обыкновенной истории» И. Гончарова и Милда в «Крутом маршруте» Е. Гинзбург.
С конца 1970-х Толмачёва начала заниматься режиссурой. В 1977 году, по поручению Галины Волчек, она поставила спектакль «Фантазии Фарятьева» Аллы Соколовой со Станиславом Садальским в главной роли, в 1978 — «Генриха IV» Луиджи Пиранделло, а в 1980 году, по приглашению Олега Ефремова, — «Всё кончено» Эдварда Олби во МХАТе с Марией Бабановой (спектакль был записан для телевидения).
Лилия Толмачёва скончалась в Москве после продолжительной болезни ночью 25 августа 2013 года в возрасте 81 года. Её похоронили 29 августа 2013 года на Ваганьковском кладбище рядом с мужем.