Сергей Пускепалис родился в Курске 15 апреля 1966 года . Рос в семье геолога, часто был в разъездах. Долгое время прожил на Чукотке в городе Билибино. После школы уехал в Саратов, где поступил в театральное училище на курс Юрия Киселева. Окончив училище ушел по призыву в вооруженные силы. Служил на флоте, в 1988 году вернулся в звании старшины первой статьи и устроился в Театр юного зрителя Саратова, которым руководил тот же Юрий Киселев.
Самые известные роли с его участием: «Эти свободные бабочки» и «Женитьба Белугина», где исполнил главные роли. Сергей всегда мечтал о поступлении в Российский Институт Театрального Искусства и поступил в конце 1990-х годов, попав на курс Петра Фоменко. На каникулах студент вместе с самарскими актерами принимал участие в постановке разных пьес. Среди участников этих проектов являлся сценарист и драматург Алексей Слаповский.
Так, появился необычный молодой самарский коллектив «Понедельник», который выступал на разных сценах. Режиссером выступал Пускепалис. Свой дипломный спектакль «Двадцать семь», выпускник театрального вуза так же поставил по пьесе Алексея Слаповского. Оказавшись очень удачным, постановку представили на фестивале «Балтийский дом».
Сергею удалось поработать под руководством Петра Фоменко, являлся ассистентом режиссера при постановке спектакля «Египетские ночи». В 2002 году Пускепалисом поставлен спектакль «Жизнь прекрасна». Зрителям представил свою работу на сцене Театра драмы и комедии Камчатки. На протяжении четырех лет, начиная с 2003 года, Сергей трудился в должности главного режиссера в Театре драмы города Магнитогорска.
За это время поставил ряд спектаклей: «Сирена и Виктория», «Володя», «Любовь к ближнему», «Исполнитель желаний», «Козий остров». С середины 2009 по февраль 2010 года Пускепалис в академическом театре драмы города Ярославля занимал должность главного режиссера. На его сцене являлся режиссером спектаклей «С любимыми не расставайтесь», «Три сестры».
Кино долгое время не было частью творческой жизни Сергея. Дебютировал в эпизоде кинокартины «Прогулка», которая снята Алексеем Учителем. Когда же его сын Глеб принимал участие в съемках фильма «Коктебель» у Алексея Попогребского, Сергей познакомился с этим режиссером. Вскоре Попогребский начал искать актеров на роли для своей очередной картины «Простые вещи», и предложил сняться в главной роли Пускепалису. Тот принял предложение и сыграл врача-анестезиолога Сергея Маслова.
В 2010 году Сергея пригласили на главную роль в картину с необычным названием «Как я провел этим летом». По сюжету два человека разных формаций и возрастов вынуждены рядом жить, здесь же затронута извечная проблема взаимоотношения отцов и детей. Сергей сыграл бывалого начальника полярной станции. Вторую главную роль сыграл Григорий Добрыгин. Его герой: практикант-стажер Павел. Съемки шли на настоящей полярной станции на севере Чукотки на протяжении трех летних месяцев. Именно это и позволило фильму быть очень близким к реальности. Погодные условия, не смотря на лето, оказались дичайшими. Фильм получился необычным, но зрители его приняли с восторгом. Отметил эту картину и Берлинский кинофестиваль, на котором исполнители главных ролей получили призы «Серебряный медведь».
В следующем, 2011 году году актер появился в фильмах: «Мой парень — ангел» и «Сибирь. Монамур». Через год снялся в кинолентах: «Метро», «Развод», «Жизнь и судьба». В 2013 году сыграл капитана государственной безопасности в телесериале «Крик совы» и «Черное море».
В августе 2014 года в рамках международного фестиваля «Край света» Сергей Пускепалис в качестве почетного гостя и члена жюри посетил Сахалин. Через год на кинофестивале «Золотой абрикос» в Ереване состоялась премьера фильма «Клинч», который Сергей снял в качестве кинорежиссера. Это экранизация пьесы Алексея Слаповского, которую Пускепалис ставил в Уфе.
Указом министра культуры России 4 декабря 2018 года Пускепалис назначен заместителем художественного руководителя МХАТ имени Горького по творческой работе.
Актер и режиссер Сергей Пускепалис, 16 августа 2019 года стал победителем конкурса концепций развития Театра имени Федора Волкова в Ярославле и назначен его художественным руководителем. В 2019 году стал членом совета по культуре Росгвардии.
Погиб 20 сентября 2022 года в автокатастрофе в Ярославской области, неподалеку от въезда в Ростов. Сергей Пускепалис перегонял купленный им микроавтобус для военных в Донбассе. Авария произошла в 11:14 на 202 км трассы М-8 в Ростовский районе, рядом с деревней Песочное. После столкновения с двумя многотонными фурами, автомобиль смяло и выкинуло с дороги. Микроавтобус «Форд-Транзит» по касательной столкнулся с грузовиком «Скания», который ехал по встречке. Из-за этого «Форд» выкинуло с полосы, и машина столкнулась с фурой «Даф». Сергей Пускепалис был на пассажирском сиденье. За рулем машины был водитель Волковского театра 57-летний Александр Синицын.