Николай Васильевич Склифосовский родился 6 апреля 1836 года в поселке Дзержинское, Молдова. Его дед по отцовской линии носил фамилию Склифос, но отец будущего врача видоизменил ее после принятия елеопомазания в Русской Православной Церкви города Дубоссары, где Николай был крещен при рождении.
Николай Васильевич получил среднее образование во второй Одесской гимназии, которую окончил с серебряной медалью. В 1859 году он стал выпускником медицинского факультета Московского университета и уже в юном возрасте принял на себя заведование хирургическим отделением одесской городской больницы.
В 1863 году Николай Васильевич получил степень доктора медицины в Харькове за диссертацию «О кровяной околоматочной опухоли». Через три года он начал работать в Германии в патологоанатомическом институте профессора Вирхова и хирургической клинике профессора Лангенбека. Затем он работал в прусской армии на перевязочных пунктах и в военном лазарете, а также во Франции у Кломарта и в клинике Нелатона, и в Англии у Симпсона.
Имя Николая Васильевича Склифосовского стало известно в медицинском мире. В 1870 году по рекомендации Пирогова он получил приглашение занять кафедру хирургии в Киевском университете, но там он оставался недолго.
В 1871 году, после возвращения с франко-прусской войны, Николай Склифосовский был назначен на кафедру хирургической патологии Медико-хирургической академии в Санкт-Петербурге. Первоначально он преподавал хирургическую патологию и возглавлял хирургическое отделение в клиническом военном госпитале, а позже возглавил хирургическую клинику барона Вили. Опубликовав серию работ, он быстро стал популярным профессором и хирургом.
В 1876 году Николай Склифосовский отправился в Черногорию в качестве хирургического консультанта Красного Креста. Русско-турецкая война, разразившаяся позже, в 1877 году, призвала его в действующую армию. Склифосовский лечил первых раненых во время форсирования Дуная, работал хирургом в русской армии под Плевеном и на Шипкинском перевале.
Отчеты указывают на то, что за этот период через его больницы прошло около десяти тысяч раненых. Врачи и медсестры, включая его жену Софью Александровну, поддерживали его, время от времени вливая ему в рот несколько глотков вина, чтобы он не сдавался.
Николай Склифосовский никогда не отступал от своих благородных правил общения, и никто никогда не видел, чтобы он выходил из себя или терял самообладание. В то же время ученый был очень эмоциональным и страстным. Например, первая операция, обычно проводимая без хлороформной анестезии, произвела такое сильное впечатление на молодого студента-медика Николая Склифосовского, что он упал в обморок. Позже он стал первым в мире, применившим местную анестезию.
После возвращения в Санкт-Петербург Николай Склифосовский был назначен директором клинического института усовершенствования врачей «Побег» и заведующим одним из его хирургических отделений. Он оставался там до 1902 года, преподавая практическую хирургию врачам, которые приезжали на курсы со всей России. Из-за тяжелой болезни Николай Склифосовский вышел на пенсию, а позже переехал в свое имение в Полтавской губернии.
Последние годы жизни он провел в имении Яковцы, деля свой досуг между садоводством и изучением новых книг по медицине и хирургических журналов, включая «Хронику русских хирургов» и «Хирургическую хронику», редактором и основателем которых он был.
Николай Склифосовский скончался 13 декабря 1904 года в результате инсульта. Великий русский ученый был похоронен на кладбище в Яковцах, где когда-то произошла Полтавская битва.