Широкую известность ему принесла роль Саида в фильме «Белое солнце пустыни», а также пана Директора в «Кабачке «13 стульев». Многим зрителям актёр запомнился по картинам «Человек с бульвара Капуцинов» и «Достояние республики». Среди ярких театральных работ артиста — главные роли в спектаклях «Двенадцать стульев», «Золотой телёнок» и «Малыш и Карлсон, который живёт на крыше».
Его мать, Анна Мишулина, работала заместителем наркома промышленности. Сына она родила в гражданском браке. Воспитывал Спартака его родной дядя, который увлекался древней историей и предложил назвать племянника в честь знаменитого римского гладиатора.
Когда Спартаку исполнилось 10 лет, его мать арестовали как «врага народа» и сослали в Ташкент. Мальчик остался на попечении отчима и нередко убегал из дома.
В 1942 году Мишулин учился в артиллерийской школе в городе Анджеро‑Суджинске Кемеровской области, где руководил художественной самодеятельностью.
По доносу был осужден за порчу плаката с изображением Сталина и провел несколько лет в заключении.
После освобождения Спартак Мишулин работал художественным руководителем агитбригады в домах культуры деревень Брусово и Удомля Тверской области.
В начале 1950‑х годов поступил во вспомогательный состав Калининского драматического театра. Проработав там несколько лет, перешёл в труппу Омского драматического театра, затем снова вернулся в Калинин.
Играл в спектаклях «Свадьба с приданым» Николая Дьяконова (Курочкин), «Иркутская история» Алексея Арбузова (Сергей), «На той стороне» Анатолия Барянова (Денисов), «Три сестры» Антона Чехова (Тузенбах) и др.
В 1960 году, после гастролей Калининского театра в Москве, Спартак Мишулин был приглашён сразу в три столичных театра — Ленком, ЦАТСА и Сатиры. Он выбрал Московский академический театр сатиры, где работал до последних дней.
Играл роли Остапа Бендера в «Двенадцати стульях» по Илье Ильфу и Евгению Петрову, Скапена в «Плутнях Скапена» Жана Батиста Мольера, Пичема в «Трехгрошовой опере» Бертольда Брехта. Среди его работ — Калабушкин в «Самоубийце» Николая Эрдмана, Крамнэгел в одноименном спектакле Питера Устинова, Хлынов в «Горячем сердце» Александра Островского, Бораенко в «Счастливцеве‑Несчастливцеве» Григория Горина, Джениаро в спектакле «Неаполь ‑ город миллионеров» по Эдуардо де Филиппо.
В течение 35 лет Спартак Мишулин играл Карлсона в детском спектакле театра «Малыш и Карлсон, который живет на крыше» по Астрид Линдгрен.
В Московском новом драматическом театре Мишулин исполнял главные роли в спектаклях «Малыш и Карлсон» (1996) и «Журден» (1998) по пьесе Мольера.
В 1999 году специально для Спартака Мишулина режиссер театра «Модернъ» Светлана Врагова поставила «Счастливое событие» по пьесе Славомира Мрожека.
Популярность артисту принесла телевизионная развлекательная программа «Кабачок «13 стульев» (1968‑1981), в которой актер играл роль пана Директора.
Одна из наиболее известных его ролей в кино — роль Саида в «Белом солнце пустыни» (1968). В 1971 году он сыграл Илью Тараканова в приключенческом детективе Владимира Бычкова «Достояние республики». Спартак Мишулин снимался в фильмах «Нет дыма без огня» (1972), «Талисман» (1983), «Перикола» (1984), «Хорошо сидим!» (1986), «Человек с бульвара Капуцинов» (1987), «Частный детектив, или Операция «Кооперация» (1989), «Очарованный странник» (1990), «Бравые парни» (1993), «Мастер и Маргарита» (1994), «Бедная Саша» (1997), «Бременские музыканты и Со» (2000), сериале «Не в деньгах счастье» (2005) и др.
Последней его ролью в кино стал персонаж Дед Щукарь в фильме «На реке Девице» режиссера Василия Панина.
Актер до последнего времени продолжал играть на сцене Театра Сатиры ‑ он был занят в юбилейном спектакле «Нам все еще смешно» (2004).
17 июля 2005 года Спартак Мишулин скончался в Москве. Похоронен на Ваганьковском кладбище.
В 1981 году Мишулину было присвоено звание Народный артист РСФСР. Он был лауреатом Государственной премии РФ в области литературы и искусства 1997 года, награжден орденом Почета (1996) и орденом Дружбы (2002). Актер был удостоен Премии имени И. Смоктуновского и Премии имени братьев Люмьер.
Спартак Мишулин был женат. Его дочь Карина стала актрисой и работает в Театре Сатиры.
